mRNA藥物制備的關鍵技術——切向流過濾的高效應用
時間：2024.07.15
mRNA藥物作為一種新型的生物制藥技術，因其在治療和預防疾病方面的潛力而受到廣泛關注。切向流過濾（TFF）技術高效率、高回收率特點，在mRNA藥物制備中作用很大。
一、什么是mRNA？
mRNA是細胞中的一種核糖核酸，它攜帶遺傳信息，指導細胞制造特定的蛋白質。在mRNA藥物中，人工合成的mRNA被設計用來編碼治療性蛋白質，這些蛋白質可以用于治療或預防疾病。
二、mRNA藥物工作原理
編碼設計：科學家設計并合成一段特定的mRNA序列，這段序列編碼了一種治療性的蛋白質。
傳遞進入細胞：為了確保mRNA藥物有效進入患者細胞內，需要一種有效的傳遞系統如脂質納米顆粒（LNP），對其進行包裹保護，防止mRNA在到達作用部位前被酶解或無法穿透細胞膜。
蛋白質合成：一旦mRNA進入細胞，它就會被細胞的蛋白質合成機制識別，并指導細胞合成所需的治療性蛋白質。
傳遞進入細胞：為了確保mRNA藥物有效進入患者細胞內，需要一種有效的傳遞系統如脂質納米顆粒（LNP），對其進行包裹保護，防止mRNA在到達作用部位前被酶解或無法穿透細胞膜。
蛋白質合成：一旦mRNA進入細胞，它就會被細胞的蛋白質合成機制識別，并指導細胞合成所需的治療性蛋白質。
三、TFF技術在mRNA藥物制備中的應用
1、mRNA生產工藝步驟
mRNA的生產工藝步驟基本上分為以上三個步驟，質粒DNA原液制備的基礎是轉錄模板的序列設計，制備方法通常采用質粒DNA擴增，也可采用PCR擴增。以DNA擴增為例，通常采用工程菌E.coli發酵來擴增。先進行菌種復蘇，質粒DNA的生產經過發酵培養、收獲澄清、精制純化、線性化、分裝儲存等步驟。mRNA原液制備主要工藝包括將線性化質粒DNA體外轉錄（IVT）為mRNA，進行化學修飾后分離純化，純化后的mRNA原液分裝凍存。mRNA制劑的主要工藝包括mRNA-LNP包封制備、純化、除菌過濾、無菌灌裝等。我們本文將重點討論哪些步驟需要用到TFF工藝，如何選擇膜包和中空纖維，具體用到哪些規格等。
2、質粒DNA原液制備
上游質粒擴增的主要工藝是通過E.coli發酵，培養結束后，需要對菌體進行收集。實驗室離心機受限于其操作，難以滿足商業化規模化生產，工業上連續流離心機剪切力較高。而中空纖維有開放式的通道，能夠處理高固含量、高粘度、剪切敏感的樣品，并且具有良好的放大能力。收集采用750kD/100nm的中空纖維膜柱，去除細胞碎片及培養基組分。接下來采用高壓均質機破碎、超聲裂解、堿裂解進行菌體裂解，通過深層過濾進行澄清。為便于層析純化，在層析上樣前，先采用TFF進行濃縮和換液，以大大減少樣品體積，同時去除部分RNA、HCP、HCD等雜質。
依據質粒DNA分子量大小選用30kD/100kD/300kD，TMP小于0.5bar。然后，通過層析進行精制純化。經過層析后質粒DNA的純度已經很高，根據線性化步驟的需要，可以先進行超濾濃縮換液，依據質粒DNA分子量大小選用30kD/100kD/300kD，再采用限制性內切酶完成質粒DNA的線性化。完成線性化后，采用除菌過濾來控制微生物負荷。
由于質粒DNA為胞內產物，并且生產特定長度和序列的mRNA需要高度純化且線性化的質粒原料，整個下游純化過程工藝路線較為復雜，收率不高（30%~40%），這造成行業的質粒生產成本較高，如何優化和改良下游純化工藝，成為目前質粒DNA制備環節中急需解決的問題。
mRNA的生產工藝步驟基本上分為以上三個步驟，質粒DNA原液制備的基礎是轉錄模板的序列設計，制備方法通常采用質粒DNA擴增，也可采用PCR擴增。以DNA擴增為例，通常采用工程菌E.coli發酵來擴增。先進行菌種復蘇，質粒DNA的生產經過發酵培養、收獲澄清、精制純化、線性化、分裝儲存等步驟。mRNA原液制備主要工藝包括將線性化質粒DNA體外轉錄（IVT）為mRNA，進行化學修飾后分離純化，純化后的mRNA原液分裝凍存。mRNA制劑的主要工藝包括mRNA-LNP包封制備、純化、除菌過濾、無菌灌裝等。我們本文將重點討論哪些步驟需要用到TFF工藝，如何選擇膜包和中空纖維，具體用到哪些規格等。
2、質粒DNA原液制備
上游質粒擴增的主要工藝是通過E.coli發酵，培養結束后，需要對菌體進行收集。實驗室離心機受限于其操作，難以滿足商業化規模化生產，工業上連續流離心機剪切力較高。而中空纖維有開放式的通道，能夠處理高固含量、高粘度、剪切敏感的樣品，并且具有良好的放大能力。收集采用750kD/100nm的中空纖維膜柱，去除細胞碎片及培養基組分。接下來采用高壓均質機破碎、超聲裂解、堿裂解進行菌體裂解，通過深層過濾進行澄清。為便于層析純化，在層析上樣前，先采用TFF進行濃縮和換液，以大大減少樣品體積，同時去除部分RNA、HCP、HCD等雜質。
依據質粒DNA分子量大小選用30kD/100kD/300kD，TMP小于0.5bar。然后，通過層析進行精制純化。經過層析后質粒DNA的純度已經很高，根據線性化步驟的需要，可以先進行超濾濃縮換液，依據質粒DNA分子量大小選用30kD/100kD/300kD，再采用限制性內切酶完成質粒DNA的線性化。完成線性化后，采用除菌過濾來控制微生物負荷。
由于質粒DNA為胞內產物，并且生產特定長度和序列的mRNA需要高度純化且線性化的質粒原料，整個下游純化過程工藝路線較為復雜，收率不高（30%~40%），這造成行業的質粒生產成本較高，如何優化和改良下游純化工藝，成為目前質粒DNA制備環節中急需解決的問題。
3、mRNA原液制備
體外轉錄（IVT）和修飾是mRNA原液制備的關鍵工藝，涉及多個步驟，包括轉錄、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、去磷酸化等步驟，轉錄和修飾后，可采用30kD/100kD/300kD的膜包和中空纖維膜柱去除RNA聚合酶、DNA片段、NTPs、加帽酶、dsRNA、抑制劑等雜質，并置換buffer。然后采用親和層析、尺寸排阻層析、離子對反相層析、離子交換層析等層析工藝進行精制純化，經過前述超濾、層析等純化步驟后，mRNA已經達到相當的純度，再使用30kD/100kD/300kD膜包或中空纖維膜柱調整原液中mRNA濃度并置換buffer。采用除菌過濾來控制微生物負荷進行暫存封裝。
體外轉錄（IVT）和修飾是mRNA原液制備的關鍵工藝，涉及多個步驟，包括轉錄、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、去磷酸化等步驟，轉錄和修飾后，可采用30kD/100kD/300kD的膜包和中空纖維膜柱去除RNA聚合酶、DNA片段、NTPs、加帽酶、dsRNA、抑制劑等雜質，并置換buffer。然后采用親和層析、尺寸排阻層析、離子對反相層析、離子交換層析等層析工藝進行精制純化，經過前述超濾、層析等純化步驟后，mRNA已經達到相當的純度，再使用30kD/100kD/300kD膜包或中空纖維膜柱調整原液中mRNA濃度并置換buffer。采用除菌過濾來控制微生物負荷進行暫存封裝。
4、mRNA制劑制備
mRNA-LNP包封制備是mRNA制劑制備的關鍵工藝，除了脂質成分配方外，就是工藝過程的控制了，即如何控制mRNA與脂質成分的接觸和相互作用過程，通過微流控技術以形成穩定、均一、收率高的mRNA-LNP復合物。mRNA-LNP溶液通過100kD/300kD TFF技術進行濃縮換液，mRNA-LNP復合物被截留，乙醇、制劑被洗濾。最后除菌過濾采用0.22μm除菌級過濾器冗余設置，截留細菌等微生物污染物。最終，進行無菌灌裝。
mRNA-LNP包封制備是mRNA制劑制備的關鍵工藝，除了脂質成分配方外，就是工藝過程的控制了，即如何控制mRNA與脂質成分的接觸和相互作用過程，通過微流控技術以形成穩定、均一、收率高的mRNA-LNP復合物。mRNA-LNP溶液通過100kD/300kD TFF技術進行濃縮換液，mRNA-LNP復合物被截留，乙醇、制劑被洗濾。最后除菌過濾采用0.22μm除菌級過濾器冗余設置，截留細菌等微生物污染物。最終，進行無菌灌裝。
在mRNA技術在傳染病疫苗領域獲得突破性進展的同時，mRNA技術在其它領域的應用也正在展開。我們期待隨著科學的進步和技術的發展，mRNA技術能夠獲得更為廣泛的應用，造福廣大病患！