切向流過濾技術：重組蛋白制備的得力助手
時間：2024.06.17
蛋白質是生物大分子，具有復雜結構和多種功能。蛋白質作為生物學“中心法則”的終產物，是生命活動的主要承擔者。深入了解蛋白質結構和功能之間的關聯是解鎖“生命密碼”和揭示所有特定生物學過程機制的關鍵。雖然從天然來源中提取的蛋白質為其特征研究提供了關鍵的起始物料，但由于樣品差異，蛋白質數量匱乏和質量不一，給蛋白質生物化學領域帶來了挑戰。
因此，重組蛋白表達的概念應運而生，該過程通過載體將編碼靶蛋白（POI）的外源基因引入宿主細胞，并通過劫持宿主細胞的蛋白質制造機制產生POI的過程。
四十多年前，質粒（通常以環狀雙鏈DNA分子的形式出現）被確定為細菌中外源基因的主要信使，從而開啟了基因工程的新紀元，使重組蛋白表達成為可能。在過去四十年里，研究人員已開發了各種載體系統以及宿主細胞，包括原核生物（大腸桿菌）和真核生物（例如酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞），以產生接近其自然狀態的廣譜重組蛋白，促進生化研究、工業催化、食品加工、疫苗和治療等方面的發展。
因此，重組蛋白表達的概念應運而生，該過程通過載體將編碼靶蛋白（POI）的外源基因引入宿主細胞，并通過劫持宿主細胞的蛋白質制造機制產生POI的過程。
四十多年前，質粒（通常以環狀雙鏈DNA分子的形式出現）被確定為細菌中外源基因的主要信使，從而開啟了基因工程的新紀元，使重組蛋白表達成為可能。在過去四十年里，研究人員已開發了各種載體系統以及宿主細胞，包括原核生物（大腸桿菌）和真核生物（例如酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞），以產生接近其自然狀態的廣譜重組蛋白，促進生化研究、工業催化、食品加工、疫苗和治療等方面的發展。
高質量的重組蛋白是研究和藥物開發的重要起始材料。重組蛋白質量的關鍵屬性包括純度、寡聚狀態、熱穩定性和化學穩定性、折疊、翻譯后修飾（PTM）、活性……由于蛋白質本身的復雜性，蛋白質表達和純化往往具有挑戰性。
在對目的蛋白表達純化時，需要統一考慮和整體設計，并充分考慮上游對下游的影響。同時，不同的表達系統和培養方法也影響下游的處理過程：目的蛋白表達是否形成包涵體，目的蛋白表達定位（胞內、細胞膜內、壁膜空間和細胞外）。
重組蛋白下游工藝涉及到的膜過濾操作單元有：澄清過濾、切向流過濾、除病毒過濾及除菌過濾等步驟，不同階段的過濾工藝的開發都需要嚴格把控。
在對目的蛋白表達純化時，需要統一考慮和整體設計，并充分考慮上游對下游的影響。同時，不同的表達系統和培養方法也影響下游的處理過程：目的蛋白表達是否形成包涵體，目的蛋白表達定位（胞內、細胞膜內、壁膜空間和細胞外）。
重組蛋白下游工藝涉及到的膜過濾操作單元有：澄清過濾、切向流過濾、除病毒過濾及除菌過濾等步驟，不同階段的過濾工藝的開發都需要嚴格把控。
相比于傳統的高速離心機結合深層過濾等分離技術，切向流技術則具有高效率、低能耗、無添加化學成分，操作條件緩和等一系列優勢。
切向流過濾根據孔徑可以分成微濾和超濾，一般微濾（MF）常用于較為精細的固液分離，如重組蛋白的層析前去除細胞/細胞碎片，酵母發酵液，動植物粗提液，大腸桿菌裂解液等，省去傳統的離心和預過濾等步驟。
而超濾（UF）使用范圍更寬，膜孔徑較小，主要用于重組蛋白的脫鹽、脫醇和濃縮、內毒素和核酸去除。膜孔徑的選擇極其重要，超濾膜 1～1000kDa MWCO，微濾膜0.1～0.65um。選擇膜孔徑均一度高的濾膜，可以保證截留收率同時獲得更快地透過速度，有利于雜質的透過去除，改善實驗及生產效率，提高產品質量。
切向流過濾根據孔徑可以分成微濾和超濾，一般微濾（MF）常用于較為精細的固液分離，如重組蛋白的層析前去除細胞/細胞碎片，酵母發酵液，動植物粗提液，大腸桿菌裂解液等，省去傳統的離心和預過濾等步驟。
而超濾（UF）使用范圍更寬，膜孔徑較小，主要用于重組蛋白的脫鹽、脫醇和濃縮、內毒素和核酸去除。膜孔徑的選擇極其重要，超濾膜 1～1000kDa MWCO，微濾膜0.1～0.65um。選擇膜孔徑均一度高的濾膜，可以保證截留收率同時獲得更快地透過速度，有利于雜質的透過去除，改善實驗及生產效率，提高產品質量。
在重組蛋白的制備過程中，切向流技術主要用于以下幾個關鍵步驟：
1. 濃縮
重組蛋白在宿主細胞培養過程中往往以較低濃度存在。切向流技術可以通過選擇適當的膜孔徑，保留目標蛋白，而讓小分子如鹽分、水和代謝廢物通過，從而實現蛋白的濃縮。
2. 純化
切向流技術能夠有效去除培養基中的雜質，提高重組蛋白的純度。這一步驟對于減少潛在的免疫原性反應和提高藥物的安全性至關重要。
3. 緩沖液置換
在重組蛋白的進一步加工或儲存前，可能需要將其從一種緩沖液轉移到另一種更適合的緩沖液中。切向流技術可以在不損失蛋白活性的前提下，實現這一轉換。
切向流技術雖然廣泛地應用于重組蛋白的濃縮、分離純化，但也有一定的局限性，如果要分離的兩種產品的分子量相差不到5倍，則無法用切向流進行分離。
在重組蛋白質分離純化中，切向流技術是一項應用較廣泛的蛋白純化技術，選擇合適的膜材質、孔徑、流道網、TMP、工藝流速、剪切力等條件至關重要。單一片面的選擇在蛋白質的分離和純化中效果甚微，要結合蛋白特性、緩沖體系來開展蛋白質的分離，才能將開發的膜過濾工藝成功的放大，獲得蛋白較好的分離效果。
1. 濃縮
重組蛋白在宿主細胞培養過程中往往以較低濃度存在。切向流技術可以通過選擇適當的膜孔徑，保留目標蛋白，而讓小分子如鹽分、水和代謝廢物通過，從而實現蛋白的濃縮。
2. 純化
切向流技術能夠有效去除培養基中的雜質，提高重組蛋白的純度。這一步驟對于減少潛在的免疫原性反應和提高藥物的安全性至關重要。
3. 緩沖液置換
在重組蛋白的進一步加工或儲存前，可能需要將其從一種緩沖液轉移到另一種更適合的緩沖液中。切向流技術可以在不損失蛋白活性的前提下，實現這一轉換。
切向流技術雖然廣泛地應用于重組蛋白的濃縮、分離純化，但也有一定的局限性，如果要分離的兩種產品的分子量相差不到5倍，則無法用切向流進行分離。
在重組蛋白質分離純化中，切向流技術是一項應用較廣泛的蛋白純化技術，選擇合適的膜材質、孔徑、流道網、TMP、工藝流速、剪切力等條件至關重要。單一片面的選擇在蛋白質的分離和純化中效果甚微，要結合蛋白特性、緩沖體系來開展蛋白質的分離，才能將開發的膜過濾工藝成功的放大，獲得蛋白較好的分離效果。