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在生命科學(xué)領(lǐng)域，外泌體的研究逐漸成為熱點(diǎn)，而它在實(shí)際生活中對人們的影響也是多方面的。從癌癥的早期檢測到免疫調(diào)節(jié)，外泌體的應(yīng)用已經(jīng)滲透到醫(yī)療健康的方方面面。例如，研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以攜帶特定的miRNA，用于癌癥的無創(chuàng)診斷；它們還能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，幫助治療炎癥性疾病。

 

 

此外，外泌體在護(hù)膚領(lǐng)域也展現(xiàn)出驚人的潛力，它們能夠激活成纖維細(xì)胞，促進(jìn)膠原蛋白合成，平衡基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，維持膠原蛋白生成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，從而延緩皮膚衰老跡象。外泌體的抗氧化特性可減少自由基對細(xì)胞DNA的損傷，起到保護(hù)作用，還能提高細(xì)胞能量利用效率和代謝活性，從根本上改善細(xì)胞健康狀態(tài)。臨床數(shù)據(jù)表明，外泌體處理后，皮膚厚度增加19.3%，皺紋減少23.6%，彈性增加31.4%，使用4-8周后效果尤為明顯。然而，要真正釋放外泌體的潛力，首先需要高效、純凈的分離技術(shù)，而這正是切向流過濾技術(shù)的用武之地。
 

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種，直徑在30-150納米之間，幾乎所有類型的細(xì)胞均可分泌，它們富含膽固醇、鞘磷脂以及多種生物分子，包括蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA。這些分子不僅具有生物活性，還能在進(jìn)入靶細(xì)胞后調(diào)節(jié)其功能。例如，研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可以通過攜帶miRNA，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的活性，從而在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。

然而，外泌體的提取和純化一直是研究中的瓶頸。傳統(tǒng)的超速離心法雖然能夠獲得大量外泌體，但純度較低，且容易破壞外泌體的完整性。而切向流過濾技術(shù)的出現(xiàn)，為這一難題提供了突破性的解決方案。
 

目前外泌體提取方法主要有超速離心、SEC尺寸排阻、磁珠捕獲、超濾和切向流過濾（TFF）等方法。
（一）超速離心法

根據(jù)樣品中外泌體與其他成分在尺寸和密度上的差異，通過一系列不同離心力和離心時(shí)間的超速離心步驟，逐步去除非外泌體成分，最終將外泌體沉淀并重新懸浮。
優(yōu)點(diǎn)：去除了大部分污染物，分離得到的外泌體較純凈；適用于大體積樣本（如細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清等）；無需額外試劑，避免了化學(xué)試劑的污染。
缺點(diǎn)：需要超速離心機(jī)，設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜；高離心力可能導(dǎo)致外泌體結(jié)構(gòu)損傷，影響其完整性；回收率較低，部分外泌體可能無法有效沉淀

（二）SEC尺寸排阻法

尺寸排阻法是利用多孔球狀填料形成色譜柱，樣本流經(jīng)色譜柱時(shí)，不同尺寸的分子以不同速率流出。外泌體（30-150 nm）介于大蛋白與細(xì)胞外囊泡之間，可在特定洗脫體積內(nèi)被收集。
優(yōu)點(diǎn)：耗時(shí)短，操作簡單，無需特殊設(shè)備；重復(fù)性好且回收率高；操作溫和，最大程度保持胞外囊泡的完整形態(tài)結(jié)構(gòu)。
缺點(diǎn)：樣本會(huì)被稀釋，純度受限，不適用于超大體積的樣本。

（三）磁珠捕獲法

磁珠捕獲法是利用抗體修飾的磁珠特異性捕獲外泌體，通過磁力來進(jìn)行分離。
優(yōu)點(diǎn)：是目前分離外泌體純度最高的方法，特異性高；可排除游離核酸干擾
缺點(diǎn)：價(jià)格較貴，產(chǎn)品受抗原表達(dá)影響

（四）超濾法

超濾離心法是利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜進(jìn)行選擇性分離，小分子物質(zhì)會(huì)被過濾到膜的另一側(cè)，而大于膜孔徑的高相對分子質(zhì)量物質(zhì)則截留在超濾膜上。
優(yōu)點(diǎn)：這種方法比較簡單高效，可在短時(shí)間內(nèi)將樣本濃縮10-30倍，也不影響外泌體的生物活性。
缺點(diǎn)：外泌體可能會(huì)阻塞過濾孔，導(dǎo)致膜的壽命減短，分離效率較低；截留在膜上的外泌體間也會(huì)產(chǎn)生粘附，純度不高。
以上幾種是常見的外泌體提取方法的特點(diǎn)，關(guān)于TFF提取法會(huì)再下面詳細(xì)講解。
 

（一）保護(hù)外泌體完整性
外泌體是一種納米尺寸的柔性顆粒，其脆弱的脂質(zhì)包膜使其在分離過程中極易受到損傷。傳統(tǒng)的超速離心法在長時(shí)間的高速旋轉(zhuǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生較大的剪切力，可能破壞外泌體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其內(nèi)部生物分子的泄漏，從而影響外泌體的生物學(xué)活性和后續(xù)研究。
切向流過濾技術(shù)則通過輕柔的切向作用使外泌體流過分離界面，外泌體不直接受到流體的擠壓，極大地減小了對外泌體等柔性結(jié)構(gòu)的破壞，能夠有效保護(hù)外泌體的完整性和生物學(xué)活性，確保外泌體在分離后仍能保持其原有的功能和特性，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供可靠的樣本。
（二）高效分離與濃縮
在處理大體積樣本時(shí)，切向流過濾技術(shù)的高效性尤為突出。它能夠在較短的時(shí)間內(nèi)完成外泌體的分離和濃縮，大大提高了工作效率。通過增加濾液與納米多孔膜的接觸面積，切向流過濾技術(shù)可以使外泌體更快速地通過合適孔徑的過濾膜，實(shí)現(xiàn)與其他雜質(zhì)的分離。同時(shí)，該技術(shù)還能避免膜的堵塞，使得整個(gè)分離過程更加順暢高效。

 

相比之下，傳統(tǒng)的超速離心法需要多次離心步驟，操作繁瑣且耗時(shí)較長，而且在離心過程中還可能導(dǎo)致外泌體的損失。對于需要大量外泌體樣本的科研項(xiàng)目，如外泌體藥物研發(fā)，以及臨床應(yīng)用中的大規(guī)模外泌體生產(chǎn)來說，切向流過濾技術(shù)的高效性無疑具有巨大的優(yōu)勢。
（三）廣泛的樣本適用性
切向流過濾技術(shù)適用于多種來源的樣本，無論是血液、尿液等復(fù)雜的體液樣本，還是細(xì)胞培養(yǎng)液等相對簡單的樣本，都能實(shí)現(xiàn)外泌體的有效分離。不同類型的樣本其成分和性質(zhì)差異較大，傳統(tǒng)的單一分離方法很難滿足所有樣本的需求。而切向流過濾技術(shù)憑借其靈活的參數(shù)調(diào)整能力和獨(dú)特的工作方式，能夠適應(yīng)各種復(fù)雜的樣本環(huán)境，穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)外泌體的分離，為外泌體在不同領(lǐng)域的深入研究和應(yīng)用提供了有力支持。
（四）膜形式的選擇
 外泌體純化到底是選擇中空纖維膜柱還是盒式膜包？
1. 中空纖維膜柱（Hollow Fiber Cartridge）
特點(diǎn)：
低剪切力：切向流過濾（TFF）設(shè)計(jì)減少流體剪切力，適合保護(hù)外泌體完整性。
高處理量：適合大體積樣本（如生物反應(yīng)器培養(yǎng)液、血清等），支持連續(xù)循環(huán)濃縮。
可重復(fù)性：膜表面積大，堵塞風(fēng)險(xiǎn)較低，適合長期或多次使用。
2. 盒式膜包（Cassette）
特點(diǎn)：
快速處理：開放式流道設(shè)計(jì)，流速快。
操作簡便：安裝和清洗相對簡單，適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用。
靈活性：可靈活更換不同截留分子量（MWCO）的膜，適配不同粒徑的外泌體。
通過以上特點(diǎn)對比，優(yōu)先選擇中空纖維膜，剪切力低，流道寬，適合處理高濃外泌體濃縮液，可放大生產(chǎn)。
（五）常見操作步驟
第一步澄清，用0.2um或0.45um孔徑的膜包或中空纖維柱，通過TFF操作，大于膜孔徑的細(xì)胞碎片或顆粒保存在截留液，外泌體在透過液；
第二步濃縮和換液，使用100 kDa~500kDa MWCO的中空纖維（可以依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求選擇不同分子量大小）進(jìn)一步濃縮換液，去除小分子如蛋白類物質(zhì)；我公司的自動(dòng)超濾設(shè)備可以通過檢測和維持特定跨膜壓，最大限度減小外泌體的結(jié)構(gòu)損傷，保持外泌體功能的完整性。
（六）關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化
1、跨膜壓力（TMP）：
過高壓力導(dǎo)致膜污染和外泌體破裂，建議 <15 psi（需根據(jù)膜類型預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化）。
2、剪切力控制：
降低泵流速或選擇低剪切力膜（如中空纖維膜柱）。
3、溫度：
全程在 4℃ 操作以減少外泌體降解（尤其對活性要求高的實(shí)驗(yàn)）。

切向流過濾技術(shù)憑借其在保護(hù)外泌體完整性、高效分離與濃縮以及廣泛的樣本適用性等方面的優(yōu)勢，成為外泌體研究和應(yīng)用中不可或缺的工具。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，切向流過濾技術(shù)將為外泌體在疾病診斷、治療和藥物遞送等領(lǐng)域的應(yīng)用提供更強(qiáng)大的支持，推動(dòng)生命科學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展，為人類健康帶來更多的福祉。